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| 基因治疗研究进展与前景：肢体和心肌缺血的治疗性血管生成 | |
| 摘要：经过大量的临床前研究和临床试验，血管生成基因治疗已经成为治疗冠心病和外周血管病很有潜力的疗法。病毒和非病毒载体技术以及基于细胞的基因转移技术的发展将不断提高基因转移和表达的效率。和通常的使用编码血管生长因子基因的策略不同，利用诸如缺氧诱导因子－1α(HIF-1α)等能够调节多个促血管生成基因表达的转录因子基因是一个更加巧妙的办法。血管形成的生物学机理需要进一步阐明，以便理解为什么基因治疗对某些动脉粥样硬化和相关病理改变（如能抑制血管生长的血管内皮机能障碍）的病人无效。I期临床试验的结果证实，基因治疗是安全的，能为病人所耐受。然而，II期临床早期试验的结果表明，对冠心病和外周血管病基因治疗的疗效是有限的。基因治疗的有效性尚需大样本，随机化，有安慰剂对照的II、III期临床试验来证实。 译自--Gene Therapy (2003) 10, 285–291: Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. TA Khan, et al.
关键词：血管生成；基因转移；缺血性心脏病；冠心病；外周血管病；血管内皮生长因子；成纤维细胞生长因子 进展： ● 腺病毒载体和质粒DNA技术的改进提高了基因对心肌和骨骼肌的转染和表达效率。 ● 更新的基因转染技术，包括AAV载体和脂质体复合物，已在临床前的试验中有效地促进心肌和骨骼肌的血管生成。 ● 动物实验表明，转录调节因子HIF-1α的血管生成作用是明确的。 ● 临床前研究显示，血管内皮机能障碍等病理改变会阻碍新血管的生成。 ● I、II期临床试验结果证明，基因治疗是安全的，并初步显示对冠心病和外周血管病的疗效。 ● 临床试验中，微创心导管技术已有效地用于基因药物的递送。 前景： ● 病毒载体的进一步改进将提高其转染效率，同时降低由于炎症和免疫反应而带来的毒副作用。 ● 非病毒载体技术的进步将提高基因转染效率，同时可避免病毒载体所带来的安全性问题。 ● 基因转移与细胞治疗的结合需进一步的研究，以达到组织器官特异性表达，多基因表达以及基因程序化表达。 ● 用能调节多个血管生成基因表达的转录因子进行基因治疗可能更好。 ● 目前对影响血管形成的病理改变分子机理的研究将为如何提高基因治疗的疗效寻找有效的途径。 ● 基因药物递送方法和治疗时程将成为生血管基因治疗策略中的关键因素。 ● 生血管基因治疗对肢体和心脏缺血性疾病是否有效将取决于II、III期临床试验的结果。 血管生成基因治疗大有希望 肢体和心脏缺血性疾病的基因治疗前景看好。经过十几年的基础研究和近年来的临床试验，基因治疗业已成为治疗缺血性心血管病的有力手段。本文综述了血管生成基因治疗的研究进展，尤其是近几年的最新进展以及将来可能的发展方向。 血管形成是一个极其复杂的过程，很可能需要多个细胞因子的协同参与，才能长出新的血管。血管形成(Vasculogenesis)，毛细血管再生(angiogenesis)，动脉血管形成(arteriogenesis)是三个促进新血管生长的生理过程。血管形成见于胚胎发育中，由多能干细胞发育成新的血管。越来越多的证据表明，血管形成也可发生于成人体内，例如，内皮祖细胞从骨髓迁出，参与血管的修复生长。毛细血管再生是指毛细血管从膨大的小静脉侧长出来，首先小静脉管壁冒出小芽，然后被周围的内皮细胞分开（套叠），或被横跨的内皮细胞桥分隔（搭桥），最后形成毛细血管。此过程包括：血管舒张，渗漏性增加，蛋白溢出血管，形成胞外基质，内皮细胞增殖、迁移，最后形成血管。局部组织环境则诱导内皮细胞的分化。伤口愈合，梗死心肌周边毛细血管增生都属于毛细血管再生。动脉血管形成是指被膜发育完全的动脉血管形成过程，并最终成为真正的侧支动脉。平滑肌细胞可由多种细胞分化而来，如内皮细胞，骨髓前祖细胞等。动脉血管形成要求平滑肌细胞生长、增殖、迁移、分化，最终成为有收缩能力的细胞。此过程见于动脉粥样硬化病人，血管堵塞后，在血管造影中，可看见侧支血管的形成。 在患有冠心病(CAD)、外周血管病(PVD)的病人中，进行性的动脉堵塞经常导致侧支血管的形成，以供应缺血区血液。然而，这一天然的代偿性过程并不足以改善组织缺血状况，以致于仍需手术来再造血管。代偿性血管生成不足部分原因可能是天然的生血管因子产量太少。治疗性血管生成则是指引入外源的生血管因子（重组蛋白或基因），促进血管的形成，以改善缺血组织的血液供应。治疗性血管生成研究已进入临床前和临床试验阶段。基因治疗的优势在于：治疗基因的持续表达，局部起作用，细胞特异性，有可能一针见效。不足之处是：基因表达效率低，机体对外来物质（如病毒等）的免疫灭活，诱发炎症反应，基因可能导入其它类型细胞，基因表达缺乏调控等。蛋白治疗的优势有：药代动力学过程明确，给药剂量可控，不用病毒等免疫原性物质。不足：蛋白因子半衰期短，需反复给药，但可通过缓释技术来克服，且反复给药也不会引起炎症和免疫反应。 给药方式的选择也是很重要的。血管内给药可能引起非特异的全身性不良反应，而心肌内直接注射则可将基因表达局限在治疗部位，提高局部生长因子浓度，从而达到生血管的作用。另外，由于血管形成过程的复杂性，特别是在进行性动脉粥样硬化病人并伴有相应病理改变的情况下，单因子基因治疗可能难以达到理想的疗效。多基因治疗可能效果更好，不仅能增强生血管作用，显著改善心肌血流灌注和心脏功能，还能提高整个临床治疗的效果。 病毒和非病毒载体已研究得较清楚 在目前的血管生成基因治疗的临床试验中，腺病毒和质粒是两个用得最多的载体，原因可能是便于生产，转染效率较高，可在非增殖细胞中表达等。第一代E1区缺失的腺病毒载体的使用由于对血管内皮有损伤，以及炎症反应而受到限制。进一步将腺病毒基因组中的不必要片段删除掉，以降低其毒副作用，减少在心血管病基因治疗中的炎症反应，并提高基因的表达量，延长表达时间。E1区和E4区同时缺失的第二代腺病毒载体就具有这样的特性，同时不影响内皮依赖的血管舒张功能。然而，由于第二代腺病毒载体仍然保留了低水平的晚期基因表达，尽管已经很轻微，但还是有炎症反应，从而导致基因表达的时间有限（＜28天＝。将腺病毒的所有基因全缺失掉，就能彻底消除晚期基因的表达以及与之有关的炎症反应。这样即使病人血液中存在抗腺病毒的中和性抗体，也不会影响基因的表达。通过辅助病毒提供病毒复制和包装所需的蛋白，就可生产出这种基因全缺失的腺病毒载体。基因全缺失的腺病毒载体，又叫无内脏或辅助病毒依赖的腺病毒载体，研究证明，在免疫机能健全的小鼠和预先用这种血清型的腺病毒免疫过的小鼠身上肌肉注射给药，治疗基因EPO均能长时间地有效表达。这一结果对于基因治疗的临床应用意义重大，因为有相当一部分病人在治疗前已经存在腺病毒的抗体。另外，腺相关病毒（AAV）对于血管生成基因治疗来说，也是一个很好的载体。AAV的优势在于：能转染非分裂细胞，基因表达时间长，炎症反应轻等，不足之处：生产困难，插入外源基因的容量小。 临床试验中所用的非病毒基因治疗载体包括质粒DNA和脂质体复合物。非病毒载体避开了病毒载体所带来的毒副作用。但质粒DNA和脂质体复合物跟腺病毒一样，也能引起炎症。尽管非病毒载体易于制备，并能形成规模生产，但其基因转移和表达效率低下仍是困扰其发展的主要障碍。最近有研究表明，超声波有助于提高质粒的转移效率。超声波配合微泡回声比差剂能使细胞膜的通透性增加，从而显著提高裸DNA的转移和表达效率。这项胞膜渗透技术，或叫超声成孔技术，能在细胞膜表面瞬间造成小孔，DNA则趁机进入细胞内，实验证明，这一技术使质粒DNA的表达效率提高了近300倍。在体外培养的人骨骼肌细胞中，该技术则使荧光素酶质粒的转染效率提高了近10倍。研究者进一步在HGF质粒治疗后肢缺血的兔子模型中证实了此方法的效果， 血管造影和毛细血管密度均显示好于单纯质粒组。该方法也能提高质粒DNA对人主动脉内皮细胞和血管平滑肌细胞的转染效率而无明显的毒性。此技术很有可能提高质粒DNA对人心肌组织的转染效率。脂质体的转染效率则可通过阳离子多聚物的改进而得到提高。动物实验显示，脂质体介导的血管生长因子治疗缺血性疾病是有效的。在后肢缺血的兔子模型中，阳离子脂质体介导的VEGF基因转染，使患肢血管生长，血流增加。实验证明，脂质体介导的HGF基因治疗同样有效。日本凝血病毒（hemagglutinating virus of Japan, HVJ）－脂质体包裹HGF基因使正常和梗塞的心肌内长出新生血管。 细胞疗法具有创新性，它以自体细胞为载体，在体外将治疗基因导入细胞，再植入体内。由于使用的是自体细胞，避免了免疫排斥反应和炎症的发生，由于在体外进行转基因操作，就可采用各种技术获得稳定表达生血管基因的细胞株，表达时间也大大延长。这些转基因技术包括：电穿孔，逆转录病毒或慢病毒介导的基因整合。另外还可构建复杂的基因表达结构，以实现稳定表达，可控表达和多基因表达。目前的研究主要集中在利用骨骼肌母细胞和血管母细胞，转基因后，移植到缺血组织，以诱导血管的再生。 VEGF和FGF是最热门的两个基因 生理和病理性的血管生成与多种生长因子和转录因子有关。在CAD和PVD的基因治疗临床试验中，治疗基因多以生长因子为主。VEGF和FGF是其中最热门的两个基因，特别是编码121个氨基酸的VEGF1和编码165个氨基酸的VEGF2，FGF1和FGF4。大量的临床前研究表明，这两个基因促血管生成的作用是明确的。其它的基因包括转录因子基因，如缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)。许多与血管生成有关的基因的表达，包括VEGF和VEGF受体FLT-1，都受HIF-1α的调控。将HIF-1α的DNA结合和二聚化结构域与单纯疱疹病毒VP16蛋白反式激活结构域进行拼接，形成一杂合分子，该分子具有持续的HIF-1α活性。有关的临床前研究结果详见后述。另外一个调节血管生成的新的因子叫PR39多肽。此肽通过抑制HIF-1α被泛素-蛋白复合体的降解而增加其在细胞中的浓度。研究证明，PR39能提高VEGF，VEGF受体KDR和FLT-1，以及FGF受体1的表达。PR39最大的问题是特异性较差，据信与电荷有关，此问题正在研究之中。 临床前和临床试验证明：PVD的基因治疗是安全的并显示了初步的疗效 以质粒和腺病毒为载体，对慢性肢体缺血动物模型进行血管生成的基因治疗，这方面的研究已比较成熟。在VEGF基因的临床前研究中，常用的载体为非病毒和腺病毒载体。最近，有研究者用AAV作载体携带VEGF基因，同样在肢体缺血的动物模型上取得了疗效。在大鼠后肢缺血模型中，注射AAV-VEGF使缺血肢体血流增加，毛细血管生长，与对照相比，差别明显。HGF也是一个新出现的血管生长因子。在兔后肢缺血模型中，肌肉注射人HGF质粒，血管造影显示，缺血肢侧支循环增加，血流增加，血压上升。而且，最新的证据显示，FGF-2能够调节HGF的表达。 最近的临床试验进一步研究了血管生成基因治疗对PVD的疗效及付作用，如新生血管数增加，以及众所周知的付作用，如水肿等。在被观察的90名患者中，VEGF165基因通过动脉或肌肉给药，下肢末端水肿的发生率为34%，且伴有静息痛和缺血性溃疡的患者比单纯腿瘸的患者更常见。血管渗透性的增加是由VEGF引起的。最近，用VEGF-1基因对慢性肢体缺血治疗的II期临床试验结果已经公布。该实验采用随机分组，安慰剂对照，双盲设计，在血管再成形术后，通过动脉，用导管将表达VEGF-1的腺病毒或脂质体注射到治疗组病人的病变部位，而对照组病人只给予晶体样溶液。数字减影血管成像(DSA, digital subtraction angiography)显示，腺病毒载体组和脂质体组均使远离给药部位的血管数增加。而且，腺病毒载体组对严重缺血患者的疗效更好些。然而，下肢末端与上肢末端血压比，或踝-臂指数(ABI)，在治疗组和对照组之间没有区别。另外，在腺病毒载体组中，18个病人有11个病人的腺病毒抗体增加。 冠心病基因治疗I/II期临床试验已经完成 临床前研究已经证明基因治疗冠心病是有效的。FGF和VEGF两个基因研究得最多。在最近的一份报告中，将猪造成心肌缺血模型，Ad-VEGF121直接注入心肌，结果表明，基因表达是一过性的，且集中在靶组织――心肌缺血区。局部表达的VEGF比经冠脉给药的浓度大10倍，而且使局部心肌血流改善。其它一些最新的研究也报道了各种技术策略，并在动物模型上取得了可喜的效果。在心肌缺血的小鼠模型中，将AAV-VEGF注入缺血心肌周围，结果血管生成，而无炎症反应。在后肢缺血的兔子模型中，HIF-1α/VP16杂合基因转染使局部血流和毛细血管密度增加。在急性心肌缺血的大鼠模型中，心肌内注射HIF-1α/VP16杂合基因质粒使心肌梗塞面积减小，梗塞周围的毛细血管密度增加。其诱导血管生成的作用与VEGF相似。在转入猪PR39cDNA的转基因小鼠中，经CD-31分子染色显示血管结构，发现转基因鼠比同龄的对照鼠血管生成能力强。这些结果表明，象HIF-1α，PR39等能刺激多个生血管因子产生的基因，可能更有效，而成为一种新的策略。 冠心病基因治疗临床试验的结果已有报道。这些试验包括无对照的，公开标记的，主要考查安全性和可行性的I期临床试验。对这些试验的结果在下结论时要小心，因为冠心病患者的安慰剂效应很强。在一个以129例病人为对照组的I期和II期临床试验中，患者同时接受基因治疗和激光心肌血管再造术，治疗前，CCS(Canadian Cardiovascular Society)心绞痛分级平均为3.0±0.5，治疗后6个月，为2.1±0.6(P<0.001)，其中有24.8%的病人心绞痛分级的改善情况≥2。平均的随访时间为30±6个月，随访终止时，CCS心绞痛分级平均为2.3±0.8(P<0.001)。该研究的结果消除了严重冠心病患者的安慰剂效应。 最近发表了两个研究报告，均通过小型外科手术将基因导入心脏。一个是在I期临床，用VEGF165质粒治疗7个病例，和先前的结果相似，硝酸甘油服用量显著减少，CCS心绞痛分级明显降低，单光子发射计算机断层成像(SPECT, single-photon emission computed tomography)和冠脉造影显示，心肌血液灌流改善。另一个是用VEGF-2质粒治疗11例慢性稳定型心绞痛患者，结果显示，心绞痛发作次数和硝酸甘油用量减少，运动耐受测试(ETT, exercise treadmill testing)有改善。 最新报道的两个临床试验，则采用心导管技术，将VEGF-2质粒注入心肌。其中一个采用随机分组，单盲法和安慰剂对照设计，对6例患者进行了初步的安全性和可行性研究。治疗后90天，与对照组相比，心绞痛症状减轻。机电作图和SPECT显示，心肌缺血区域缩小，血液灌流改善。另一个进行了多中心，随机分组，双盲法和有安慰剂对照的I/II期临床试验。VEGF-2质粒的用量逐渐加大，病例选择CCS心绞痛分级在III-IV级的患者。将导管插入心脏内表面给药，对血液动力学没有影响，不会产生持续的室性心律失常，心电图显示，无梗塞发生。最近一份阶段性报告显示，19例病人中，治疗组的心绞痛症状比对照组明显减轻。虽然从总体来看，基因治疗是有效的，但以VEGF-A和VEGF-B基因作为冠脉搭桥术的辅助手段，则显效甚微。 代号为AGENT(angiogenic gene therapy)的方案是第一个采用随机分组，双盲法和有安慰剂对照的基因治疗冠心病临床试验。该方案以腺病毒为载体，携带FGF-4基因，冠脉内给药，共79例患慢性稳定性心绞痛病人，按1：3的比例随机分组，其中19例作为对照组，余下60例为治疗组。结果显示，总的来说，该方案是安全的，能为病人所耐受。超声心动图可见，两组间紧张诱导的心壁运动无显著差别。治疗后4周和12周，病人的ETT没有改善的趋势。而从亚组的分析来看，治疗前ETT<10分钟的患者则有显著的改善。 临床试验设计考虑要点 血管生成基因治疗为冠心病和外周血管病晚期患者开辟了新的治疗途径。但目前尚缺少大样本，随机化，双盲以及有安慰剂对照的临床试验结果。对于临床试验病人的登记，随机化分组应考虑到病人自身侧支循环的形成。入选病例大多在基因治疗前已接受各种外科手术治疗。这些病人自身侧支循环形成的能力就很差，由此推测他们对基因治疗的反应很可能也是不敏感的。因此，目前进入临床试验的病例本身就有问题。理想的受试者应该是心肌缺血，但心肌尚存活，周围血流丰富的患者。排除的标准一般包括恶性肿瘤，增生性视网膜病变等，以免病理性血管生成的发生。在FGF基因治疗的临床试验中，由于考虑到肾毒性的危险，因此将肾功能异常和有蛋白尿的患者排除在外。 心脏的病变和死亡包括心肌梗塞和梗死是对基因治疗结果的一种客观评价，可作为临床观察的终止点。然而，这种情况在临床试验中出现的几率较小，如果以此为终止点，则需要非常大的样本量才能得出有意义的结果。保住肢体，免于截肢可作为进行性外周血管病治疗的终止点。其它心脏病治疗的终止点包括：运动耐受试验，心肌灌流量测量（SPECT，MRI法），外周血管病则包括：血管密度（DSA，或磁共振血管成像），肢端末梢血压（ABI）以及缺血性溃疡的愈合等。肢体缺血基因治疗的疗效可以通过对跛行和静息痛等症状的改善来评价。心肌缺血症状的缓解和生活质量的提高，可以通过西雅图心绞痛问卷调查或加拿大心血管病协会心绞痛分级来测定。然而，在对参与试验的严重冠心病和外周血管病患者的研究中发现，安慰剂效应很明显。 前景 血管生成基因治疗最新进展为冠心病和外周血管病的治疗带来了希望。 病毒和非病毒载体技术的不断改进将提高基因转染和表达的效率。细胞治疗的深入研究将使基因的可控表达和多基因治疗成为可能。临床试验中，某些病人的疗效差可能与冠心病和外周血管病相关的病理生理改变有关。血管内皮机能障碍与动脉粥样硬化有关，有可能阻碍了新血管的生成。我们通过一个小的开胸手术，将FGF-2蛋白注入外周血管，以观察高胆固醇血症引起的血管内皮机能障碍对治疗性血管生成的影响。在缩窄器造成的猪慢性心肌缺血模型中，高胆固醇血症引起了明显的血管内皮机能障碍并阻碍了新血管的生成，和对照的，正常饮食组比较，表现为血液灌流不足。因此可以认为，血管内皮机能障碍是导致某些病人治疗失败的原因之一。将来如果血管内皮机能障碍的问题解决了，基因治疗的疗效也会相应地提高。 基因递送方法需进一步改进，以提高局部治疗因子浓度，延长局部滞留时间，减少进入全身循环的量。心肌和肌肉内直接给药应优于先前的血管内给药。对于某种特定的基因药物，也应先进行给药方式的优化研究，再做临床前和临床试验。多基因治疗可能提高血管生成的效果。自然的血管生成过程很可能是在不同的时间点，多个基因表达作用的结果。先后给药或同时给药也是一个重要的因素。另外，各种血管生长因子之间的协同作用机制已有初步研究。而且基因治疗的时程对于疗效的影响也是至关重要的。最近的研究表明，VEGF基因表达的时间长短将决定新生血管是否会消退。临床试验也表明，将能持续释放FGF-2因子3-4周的肝素藻酸盐微胶囊植入心脏，能更好地促进缺血心肌的血管再生。因此，血管生成基因治疗一定要保证治疗基因持续表达几周以上。 结论 血管生成基因治疗为患有冠心病和外周血管病而又无法进行手术的患者带来了希望。目前的临床试验主要集中在I期（考查基因治疗安全性），II期临床试验的结果较少，且疗效尚不确切。随着研究的深入，基因治疗的疗效将不断提高，而毒副作用将越来越小。总之，基因治疗的有效性尚需大样本，随机化，有安慰剂对照的II、III期临床试验来证实。 发布时间：2003年10月22日 |
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